Звоните на номер:

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ПОЛОВИНОК ЭМБРИОНОВ ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VIVO

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ПОЛОВИНОК ЭМБРИОНОВ ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VIVO
 
 
Валиева Г.А.
НАО «Казахский национальный аграрный исследовательский университет»
 
Введение.
В настоящее время в Казахстане никто не занимается разработкой методов клонирования соматических клеток и клонирования эмбрионов сельскохозяй-ственных животных, представляющих огромную генетическую ценность. Поэтому комплексное изучение различных проблем имеет большую практическую актуальность. В связи с этим возникает необходимость разработки методов клонирования, ценных пород сельскохозяйственных животных, в частности овец, с использованием современных биотехнологических методов.
Одна из основных ролей в решении данного вопроса отводится биотехнологии in vitro, которая в большей мере могла бы удовлетворить потребности как в производстве эмбрионов на определенных стадиях развития, так и в развитии приоритетных направлений в биотехнологии.
На основании вышеизложенного, проблема ускоренного воспроизводства высокопродуктивных особей пород и популяции сельскохозяйственных животных стала весьма актуальна. Это связано с тем, что применение традиционных методов in situ не всегда возможно и требует больших финансовых затрат. Катастрофическое сокращение численности основных видов сельскохозяйственных животных, в особенности овец, стало причиной безвозвратной потери наиболее ценной племенной их части.  В связи с этим, возникла настоятельная необходимость проведения исследований по разработке методов криоконсервации ооцитов и эмбрионов, а также клеточной биотехнологии получения монозиготных близнецов овец с целью расширения их генофонда.
         Высокий уровень воспроизводства для большинства сельскохозяйственных животных является основным требованием. В связи с этим большое значение приобретает разработка методов получения идентичных двоен у домашних животных, что важно для размножения малоплодных животных (овец, крупного рогатого скота).
Как известно, существует три вида клонирования: получение монозиготных близнецов (микроманипуляции), эмбриональное клонирование (реконструкция яйцеклеток ядрами из клеток эмбрионов) и соматическое клонирование (реконструкция яйцеклеток ядрами клеток соматических тканей), (И.А. Погорельский, 2001). Одним из важных перспективных направлений исследований, является получение с помощью микроманипуляций новых генетических копий - клонов животных. Прогресс в решении актуальной проблемы клонирования генотипов высокопродуктивных животных обусловлен разработкой методов получения генетически идентичных животных на основе разделения ранних эмбрионов методами микрохирургии и микроманипуляций на два или более бластомеров, способных развиваться в процессе всего онтогенеза, т.е. способных проявить свою тотипотентность.
Несмотря на ранее проведенные исследования, в настоящее время эти методы также интенсивно и успешно развиваются за рубежом [1,2].
            Удачная  попытка  получения  монозиготных  двоен  была предпринята  в  K. Utsumi  и др. (1988).
            7-ми суточные эмбрионы:  на стадии монозиготные двоен  у коз после извлечения помещали в фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 4% бычий сывороточный альбумин. Затем их разделяли, используя микроманипулятор и модифицированный офтальмологический микроскальпель. Внутреннюю клеточную массу эмбрионов делили на две равные части, помещали в блестящие оболочки и  после 30 мин. культивирования  переносили  к реципиентам. После трансплантации 3 реципиентам 6 разделенных  половинок  родилось две пары  идентичных двоен (2 ♂, 2 ♀) и один одиночный козленок. Общая выживаемость  половин  составила 83%. Авторы  считают, что разделение  эмбрионов  на стадий поздней  бластоцисты наиболее  удобно, так как в данном  случае  блестящая оболочка  тоньше и цитоплазма  более эластична, чем у ранней  бластоцисты.
            Таким образом, помещая  половины микрохирургически  разделенных  эмбрионов на стадиях морулы, бластоцисты в блестящие  оболочки  перед их пересадкой  реципиентам получают довольно высокие проценты выживаемости  полуэмбрионов  разных сельскохозяйственных животных. У коров получена выживаемость половинок разделенных эмбрионов  53,6% (Ozil et al., 1982) [3] и 21,7% (Клецко, Мадич, 1988 б) [4], у овец 52,9% (Gatica et al., 1983) [5] у коз 77,8% (Udy, 1987) [6], и 83%. Блестящая зона играет защитную роль для половин эмбрионов на стадиях морулы, бластоцисты, тем самым увеличивая их приживляемость.
            В связи с интенсивным развитием  и совершенствованием метода трансплантации  эмбрионов появилось  много работ по получению идентичных  двоен у сельскохозяйственных животных после микрохирургического  разделения зародышей и пересадке  половин  реципиентам  без помещения  их в блестящие оболочки. Были  получены  монозиготные двойни у крупного рогатого скота (Williams, Moore, 1988) [7].
            Пересадка разделенных эмбрионов крупного рогатого скота, овец, свиней реципиентам без помещения их в блестящие оболочки является  действенным методом получения идентичных двоен сельскохозяйственных животных, поскольку данный метод дает довольно высокие  проценты  приживляемости  разделенных половин, беременности после их пересадки и однояйцовых  близнецов.
            Попытки культивирования in vitro половин разделенных эмбрионов  были предприняты A.O. Trounson в работе по получению   идентичных двоен у овец [8]. Авторы механически  разделяли 4-, 6- и 7 –сут. зародыши овец на две части  и полученные  половинки культивировали в среде Дюльбекко  с добавлением  20% гетерологичной  овечьей  сыворотки  в течение 2 сут.  при 37,50С до получения нормальных бластоцист  (фактически  это было инкубирование,  так как культуральную среду   не продували  газовой смесью). Половинки 4-сут. эмбрионов плохо развивались в культуре, и большинство  полуэмбрионов диспергировались на отдельные клетки. 82 половины 6- и 7-суточных зародышей после культивирования дали 24 нормальных бластоцисты. Но из 19 бластоцист, трансплантированных  реципиентам, удалось  получить только  двух живых ягнят.
            Таким образом, культивирование in vitro половин эмбрионов после микрохирургии улучшает их дальнейшее развитие, повышает приживляемость  полуэмбрионов и процент рождаемости однояйцовых близнецов сельскохозяйственных животных.
            Обобщая изложенное, можно заключить, что разработка методов получения однояйцовых близнецов у сельскохозяйственных животных действительно имеет важное значение для повышения уровня их воспроизводства
 
Материал и методика исследований
 
Индукция суперовуляции у маток-доноров в анэстральный и эстральный сезоны
В ходе исследований была изучена функциональная активность органов-мишеней при гормональной обработке овец-доноров эмбрионов. Для индукции эстральных циклов у овцематок в анэстральный сезон применяли обработку животных внтуримышечной инъекцией эстрофана в дозе 250 мкг. Эстральные циклы выявляли в течение 1-3 дней после инъекции.
В дальнейшем для индукции суперовуляции использовали следующию схему как в анэстральный, так и в эстральный сезоны. Для индукции суперовуляции у овцематок породы чингизский на 12-й день эстрального цикла вводили Folligon (Intervet International, Netherland) в 1200 ИЕ; затем через 48 часов вводили 125 мкг эстрофана (Чехия) и в день оплодотворения вводили 1000 ИЕ хорионического гонадотропина (ХГч, Россия).
Извлечение и морфологическая оценка эмбрионов. Извлечение эмбрионов проводили хирургическим методом лапаротомии на 2-5 сутки после оплодотворения. Полученные эмбрионы после обнаружения оценивали по морфологическим признакам, для оценки использовали фазово-контрастный микроскоп Axiostarplus с объективами Achrostigmat LD 20x и 40x (Zeiss, Germany). При этом учитывались следующие основные признаки полноценности эмбрионов: целостность и равномерность развития бластомеров, прозрачность периветиллинового пространства, целостность zona pellucida, соответствие стадий развития возрасту эмбрионов.
Полноценными эмбрионами считали те эмбрионы, которые имели правильную шарообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, целостную прозрачную оболочку, одинаковый размер бластомеров с определенным характером их расположения (плотность межклеточных контактов).
К неполноценным относили эмбрионы сморщенные, деформированные с неравномерными по величине бластомерами, фрагментированной цитоплазмой, лизисом цитоплазмы, отставанием в дроблении.
Такие тщательные оценка и отбор зародышей необходим вследствие того, что зародыши, признанные полноценными будут подвергнуты микроманипуляциям для получения монозиготных близнецов.
Исследование жизнеспособности половинок эмбрионов путем культивирования in vivo
Полученные полуэмбрионы культивировали in vivo в яйцеводах синхронизированных по циклу и осемененных промежуточных реципиентов в течение 24 часов. Промежуточные реципиенты в количестве 2 овцематок были той же породы, что и овцематки-доноры эмбрионов. Реципиенты были подобраны по соответствию их половых циклов срокам развития эмбрионов. Полуэмбрионы подсаживали хирургическим путем в рога матки со стороны овуляции. Таким образом, гормональный фон рога матки соответствовал стадии развития эмбриона и создавал наиболее благоприятные условия для дальнейшего развития и имплантации полуэмбрионов. Затем извлекали полуэмбрионы и проводили морфологическую оценку качества.
 
Результаты исследований
 
Индукция суперовуляции у маток-доноров в анэстральный сезон,  морфологическая оценка качества полученных эмбрионов
В ходе проведения исследований суперовуляторной реакции яичников подопытных овец породы чингизский и сбора эмбрионов на различных стадиях развития, нами также была проведена морфологическая оценка качества эмбрионов. С целью выявления их полноценности и пригодности для дальнейших исследований по получению монозиготных близнецов  (табл. 1).
 
Таблица 1 - Влияние гонадотропинов на количество эмбрионов (Folligon (Intervet International, Netherlands) в дозе 1200 ИЕ
                                Показатели
           
Обработано овцематок, n
15
Реагировало суперовуляцией, n (%)
12  (80,0%)
Общее количество овуляций, n
73
Среднее количество овуляции на донора, n
3,50±1,7
Общее количество вымытых яйцеклеток и зародышей на донора, n
60
Получено яйцеклеток и зародышей на донора, n
2,95±0,91
Процент вымываемости, %
85,5
 
В результате применения указанной схемы гормональной обработки Folligon для индукции суперовуляции у овцематок, положительно реагировало суперовуляцией 80,7% обработанных овцематок, было выявлено 73 овуляции у 13 животных, что в среднем составило 3,50±1,7 овуляций на донора у овцематок. При хирургическом вымывании эмбрионов было извлечено 85,5 эмбрионов от общего количества овуляций, в среднем на донора 2,95±0,91 эмбрионов (табл. 1).
 
Таблица 2 - Результаты морфологической оценки качества эмбрионов после индукции суперовуляции с применением (Folligon (Intervet International, Netherlands) в дозе 1200 ИЕ в анэстральный сезон
Стадия развития
Количество, n (%)
Дегенерированные
4 (6,5)
Яйцеклетки
6 (9,7)
2-х клеточные
7 (11,3)
4-х клеточные
11 (17,7)
8-ми клеточные
12 (19,4)
16-ти клеточные
22 (35,4)
 
При проведении морфологической оценки качества эмбрионов были получены следующие результаты, отраженные в таблице 2. В ходе эксперимента были вымыты дегенерированных 4 эмбрионов, что составило 6,5% от общего количества вымытых эмбрионов, неоплодотворенных яйцеклеток 6 (9,7%), на двух клеточной стадии развития 7 (11,3%) эмбриона, четырех клеточных - 11 (17,7%) и восьми клеточных - 12 (19,4%) и 16-ти клеточных эмбрионов – 22 (35,4).
Таким образом, проведенные исследования показали эффективность применения гормональной индукции суперовуляции у овец, при котором были достигнуты хорошие результаты для анэстрального сезона, с  высоким выходом  эмбрионов хорошего качества необходимых для проведения дальнейших исследований.
     
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований получено следующее:
1. Проведенные исследования показали эффективность применения гормональной индукции суперовуляции в анэстральный сезон у овец породы казахский архаромеринос, при котором были достигнуты хорошие результаты, с  высоким выходом эмбрионов хорошего качества.
2. Изучена жизнеспособность полуэмбрионов путем культивирования in vivo. Выживаемость полуэмбрионов, полученных после разделения 2 на двух клеточной стадии развития 7 (11,3%) эмбриона, четырех клеточных - 11 (17,7%) и восьми клеточных - 12 (19,4%) и 16-ти клеточных эмбрионов – 22 (35,4).
 
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
            1  Sh.M. Mitalipov, Richard R. Yeoman, Hung-Chih Kuo, and Don P. Wolf. Monozygotic Twinning in Rhesus Monkeys by Manipulation of In Vitro-Derived Embryos. Biology of Reproduction, 2002, 66, p. 1449-1455.
2 M.Tagawa, S.Matoda, N.Narita, N.Saito, T.Nagai, K.Imai. Production of monozygotic calves using blastomere separation technique and Well of the Well culture system. Theriogenology, 2008, 69, p. 574-582
3 Ozil J.P., Heyman Y., Renard J.P. Production of monozygotic twins by micromanipulation and cervical transfer in the cow //Veterinary Record, 1982, 110, p. 126–127.
4 Клецко Н.Г., Мадич А. В. Разделение эмбрионов КРС и их транс­плантация с -целью получения монозиготных близнецов // Состояние и перспективы развития биотехнологии в животноводстве. Тез. докл. 21-22 сент. 1988; С. 77-78.
5 Gatica R., Boland M.P., Crosby T.F., Gordon I. Micromanipulation of sheep morulae to produce monozygotic twins//Theriogenology, Volume 21, Issue 4, April 1984, p. 555-560.
6 Udy G.B. Commercial splitting of goat embryos //Theriogenology, V. 28, Issue 6, 1987, p. 837-847
           7 WilliamsT.J., Moore L., Quick-splitting of bovine embryos
Theriogenology, Volume 29, Issue 2, February 1988, Pages 477-484
8 Trounson A.O., Willadsen S.M., Moor R.M. Effect of prostaglandin analoque cloprostenol on oestrus, ovulation and embryonic viability sheep //J.Agric.Sci.,1980.-86.-#3.-p.608-611.

 

Звоните на номер:
Напишите нам
По всем вопросам, просим написать на почту! 
Мы находимся по адресу:
M02E6B9

Казахстан, г. Караганда