Дата публикации: 13.10.2024
ПОЛУЧЕНИЕ ЗИГОТ КОЗ НА СТАДИИ ДВУХ ПРОНУКЛЕУСОВ
Валиева Г.А.
НАО «Казахский национальный аграрный исследовательский университет»
Проведена исследования по получению зигот на стадии двух пронуклеусов и отработка метода визуализации пронуклеусов.
Первое полноценное сообщение о получении трансгенных мышей методом трансплантации в бластоцисты эмбриональных стволовых клеток, генетически трансформированных с использованием генно-инженерной конструкции, состоящей из кДНК гена Nat1 человека под цитомегаловирусным промотором (cmv) было сделано в 2003 г группой исследователей из Оксфордского университета (Sim et al., 2003). Как и следовало ожидать, все рождённые первичные трансгенные мыши в этом эксперименте оказались химерами, но их было очень мало, т.к. наблюдалась резорбция многих эмбрионов и ненормальное развитие большей части плодов. Авторам не удалось скрестить немногочисленное потомство живых химерных мышей с целью получения гомозиготных линий трансгенных мышей, обладающих повышенной экспрессией человеческого Nat1 и способностью передавать трансген по наследству (Sim et al., 2003). Результаты этого исследования привели авторов работы к заключению, что высокий уровень экспрессии Nat1 человека у трансгенных мышей в период эмбрионального развития 16 приводит к нарушению механизма защитного действия фолата на развитие нервной трубки и гибели большей части эмбрионов или к ненормальному развитию плодов (Sim et al., 2003). [1]. После неудачных экспериментов по получению трансгенных мышей с интегрированными генами Nat человека эта группа исследователей прекратила работы в данном направлении. Позднее группа исследователей из университета штата Аризона (Cao et al., 2005) на основе анализа результатов оксфордской группы (Sim et al., 2003) предприняла попытку получить трансгенных мышей с интегрированными генами Nat1 и Nat2 человека методом микроинъекции в пронуклеусы зигот генно-инженерных конструкций, включающих кДНК генов Nat человека под cmv-промотором. Авторами было получено пять первичных (F0) трансгенных мышей с интегрированной конструкцией cmv-hNat1. С конструкцией cmv-Nat2 были получены три первичные (F0) трансгенные мыши, у которых число копий трансгена варьировало от 1 до 5. Попытки получения трансгенных мышей, гомозиготных по гену Nat1, оказались безуспешными. Авторы этого исследования также пришли к выводу о трудности достижения значительного повышения уровня экспрессии трансгена у мышей, трансгенных по генам Nat. Выживали только животные с относительно низким уровнем экспрессии трансгена (Cao et al., 2005) [1-3].
Трансген интегрируется в реципиентный геном случайным образом и зачастую в виде множества копий. Нередко экспрессия одного и того же трансгена может варьировать в широких пределах у трансгенных животных от полного ее отсутствия до уровня, превышающего экспрессию аутентичного гена [4-6].
Генетическая трансформация путем микроинъекции чужеродных генов в пронуклеус зиготы млекопитающих значительно расширяет возможности изучения вопросов биологии развития, клеточной, биологии, молекулярной генетики, иммунологии и т.д. Кроме исследования фундаментальных теоретических проблем биологии трансгенные животные могут иметь важное значение в решении задач биотехнологии такие как получение животных с заранее запланированными признаками и создание животных-продуцентов ценных биологических препаратов.
Следует отметить, что на частоту интеграции при использовании метода микроинъекции оказывают влияние такие факторы, как степень очистки инъекционного раствора, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микроинъекции, качество эмбрионов, а также способ пересадки эмбрионов реципиентам (нехирургический, хирургический, лапароскопиический) [7].
В целом, основные элементы модифицированной авторами технологии получения трансгенных мышей состоят в следующем. Усовершенствован способ вызывания суперовуляции у мышей-доноров за счёт синхронизации половых циклов у самок-доноров к моменту обработки их гонадотропином СЖК. При подготовке самок-реципиентов использован приём предварительной подсадки самок-реципиентов к вазэктомированным самцам через перегородку, который способствует стимуляции фолликулогенеза и синхронизации половых циклов у самок-реципиентов.
Как известно, для проведения исследований по получению трансгенных животных необходимо проводить микроинъекции рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы. Это обусловлено тем, что после слияния двух пронуклеусов, успешного дальнейшего развития эмбриона и после рождения, будут получено животное в геноме, которого будет интегрирована рекомбинантная ДНК. При микроинъекции рекомбинантной ДНК на более поздних стадиях развития эмбриона, будет получен животное-мозаик. В ходе проведения экспериментов по получению датированных эмбрионов (зигот на стадии двух пронуклеусов) для индукции суперовуляции у коз применяли Folligon (Intervet International, Netherlands) вышеописанный метод. Зиготы вымывали через 24, 36 и 48 часов после осеменения коз. В ходе эксперимента нами были получены следующие результаты: через 24 часа после осеменения было вымыто 20 зигот, что составило 16,5%, от общего количества овуляций (120 овуляция). Через 36 часов вымыли 26 эмбриона, что составило 21,6% и через 48 часов – 53 эмбрионов, что составило 44,1% от общего количества овуляций, соответственно. При этом следует отметить, что очень трудно выявить оптимальное время вымывания зигот в связи с тем, что Folligon (Intervet International, Netherlands) представляет собой гонадотропин сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК). Как известно и указано производителем ГСЖК (PMSG) содержит преимущественно фолликулостимулирующий гормон (ФСГ, FSH), а также и лютеинизирующий гормон (ЛГ, LH). Фолликулостимулирующий гормон стимулирует фоллкулогенез и до момента овуляции, а лютеинизирующий гормон стимулирует рост фолликулов на стадиях, предшествующих эструсу и овуляции и саму овуляцию. Однако это сочетание двух гормонов показало неравномерность суперовуляции, т.е. ооциты созревают не одновременно и овулируют в течение 12-16 часов, что приводит к большим трудностям по получению датированных зигот в исследованиях по получению трансгенных животных. В дальнейших исследованиях необходимо использование только фолликулостимулирующего гормона (FSH).
Как известно визуализация пронуклеусов козьих зигот необходима для успешной микроинъекции рекомбинантной ДНК. Однако цитоплазма козьих зигот непрозрачна из-за наличия в цитоплазме различных включений, в отличие от мышиных зигот. Для улучшения визуализации пронуклеусов зигот в эксперименте применяли центрифугирование 10000g в течение 7 мин. В эксперименте использовали 50 ооцитов и зигот, после центрифугирования для визуализации пронуклеусов их исследовали с применением контрастно-интерференционной оптики Номарского (Opton, Germany). В ходе эксперимента только у 17 зигот были визуализированы пронуклеусы, что составило 32% от общего количества исследованных ооцитов и зигот. Таким образом, центрифугирование как метод визуализации пронуклеусов козьих эмбрионов выявил 32% эффективность метода. Для получения наиболее точных и достоверных результатов необходимо проведение дальнейших исследований.
В ходе проведения исследований по изучению первичной приживляемости свежеполученных эмбрионов коз в эстральный сезон были получены следующие результаты, отраженные в таблице 1.
Таблица 1. Первичная приживляемость свежеполученных эмбрионов коз после трансплантации
Группа
эмбрионов
|
Общее количество трансплан-тированных эмбрионов, n
|
Первичная
приживляемость, n (%)
|
2 - клеточные
|
7
|
4 (57,1)
|
4 - клеточные
|
10
|
8 (80,0)
|
Таким образом, первичная приживляемость свежеполученных 2-клеточных эмбрионов коз после трансплантации реципиентам составила 57,1% и 4-клеточных 80,0%. Первичную приживляемость определяли по отсутствию эструсов у реципиентов.
Түйін
Екі пронуклеус сатысындағы зиготаны алу және пронуклеусті визуализациялау әдісін қолдануды пайдаландық.
СПИТСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S. Arylamine N-acetyltransferases: a pharmacogenomics approach to drug metabolism and endogenous function // Biochem. Soc. Trans. – 2003. – Vol. 31. – P. 615-619.
2. Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous Nacetyltransferase can be achieved in transgenic mice // Pharmacogen. J. – 2005. – Vol. 5. – C. 255-261. 8.
3. Рябых В.П., Колоскова Е.М., Езерский В.А., Трубицина Т.П., Максименко С.В. О перспективах получения трансгенных мышей–биомоделей для фармакологических и токсикологических исследований // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2015. – № 2. – С. 5-23.
4. Palmiter D.D., Brinster R.L. Transgenic mice // Cell. 1985. V.41. P.343-345
5. Серов О.Л. Перенос генов в соматические и половые клетки. Новосибирск. Наука. 1985. С.129
6. Chan A.W. Transgenic animals: current and alternative strategies // Cloning.1999. V.1. P. 25-46
7. Brinster R.L., Chen H.Y., Trumbauer M.E., Yagle M.K., Palmiter R.D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 1985. V. 82. P. 4438-4442.