Звоните на номер:

ПОЛУЧЕНИЕ ЗИГОТ КОЗ НА СТАДИИ ДВУХ ПРОНУКЛЕУСОВ

ПОЛУЧЕНИЕ ЗИГОТ КОЗ НА СТАДИИ ДВУХ ПРОНУКЛЕУСОВ
 
 
Валиева Г.А.
НАО «Казахский национальный аграрный исследовательский университет»
 
Проведена исследования по получению зигот на стадии двух пронуклеусов и отработка метода визуализации пронуклеусов.
 
Первое полноценное сообщение о получении трансгенных мышей методом трансплантации в бластоцисты эмбриональных стволовых клеток, генетически трансформированных с использованием генно-инженерной конструкции, состоящей из кДНК гена Nat1 человека под цитомегаловирусным промотором (cmv) было сделано в 2003 г группой исследователей из Оксфордского университета (Sim et al., 2003). Как и следовало ожидать, все рождённые первичные трансгенные мыши в этом эксперименте оказались химерами, но их было очень мало, т.к. наблюдалась резорбция многих эмбрионов и ненормальное развитие большей части плодов. Авторам не удалось скрестить немногочисленное потомство живых химерных мышей с целью получения гомозиготных линий трансгенных мышей, обладающих повышенной экспрессией человеческого Nat1 и способностью передавать трансген по наследству (Sim et al., 2003). Результаты этого исследования привели авторов работы к заключению, что высокий уровень экспрессии Nat1 человека у трансгенных мышей в период эмбрионального развития 16 приводит к нарушению механизма защитного действия фолата на развитие нервной трубки и гибели большей части эмбрионов или к ненормальному развитию плодов (Sim et al., 2003). [1]. После неудачных экспериментов по получению трансгенных мышей с интегрированными генами Nat человека эта группа исследователей прекратила работы в данном направлении. Позднее группа исследователей из университета штата Аризона (Cao et al., 2005) на основе анализа результатов оксфордской группы (Sim et al., 2003) предприняла попытку получить трансгенных мышей с интегрированными генами Nat1 и Nat2 человека методом микроинъекции в пронуклеусы зигот генно-инженерных конструкций, включающих кДНК генов Nat человека под cmv-промотором. Авторами было получено пять первичных (F0) трансгенных мышей с интегрированной конструкцией cmv-hNat1. С конструкцией cmv-Nat2 были получены три первичные (F0) трансгенные мыши, у которых число копий трансгена варьировало от 1 до 5. Попытки получения трансгенных мышей, гомозиготных по гену Nat1, оказались безуспешными. Авторы этого исследования также пришли к выводу о трудности достижения значительного повышения уровня экспрессии трансгена у мышей, трансгенных по генам Nat. Выживали только животные с относительно низким уровнем экспрессии трансгена (Cao et al., 2005) [1-3].
Трансген интегрируется в реципиентный геном случайным образом и зачастую в виде множества копий. Нередко экспрессия одного и того же трансгена может варьировать в широких пределах у трансгенных животных от полного ее отсутствия до уровня, превышающего экспрессию аутентичного гена [4-6].
Генетическая трансформация путем микроинъекции чужеродных генов в пронуклеус зиготы млекопитающих значительно расширяет возможности изучения вопросов биологии развития, клеточной, биологии, молекулярной генетики, иммунологии и т.д. Кроме исследования фундаментальных теоретических проблем биологии трансгенные животные могут иметь важное значение в решении задач биотехнологии такие как получение животных с заранее запланированными признаками и создание животных-продуцентов ценных биологических препаратов. 
Следует отметить, что на частоту интеграции при использовании метода микроинъекции оказывают влияние такие факторы, как степень очистки инъекционного раствора, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микроинъекции, качество эмбрионов, а также способ пересадки эмбрионов реципиентам (нехирургический, хирургический, лапароскопиический) [7].
В целом, основные элементы модифицированной авторами технологии получения трансгенных мышей состоят в следующем. Усовершенствован способ вызывания суперовуляции у мышей-доноров за счёт синхронизации половых циклов у самок-доноров к моменту обработки их гонадотропином СЖК. При подготовке самок-реципиентов использован приём предварительной подсадки самок-реципиентов к вазэктомированным самцам через перегородку, который способствует стимуляции фолликулогенеза и синхронизации половых циклов у самок-реципиентов.
Как известно, для проведения исследований по получению трансгенных животных необходимо проводить микроинъекции рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы. Это обусловлено тем, что после слияния двух пронуклеусов, успешного дальнейшего развития эмбриона и после рождения, будут получено животное в геноме, которого будет интегрирована рекомбинантная ДНК. При микроинъекции рекомбинантной ДНК на более поздних стадиях развития эмбриона, будет получен животное-мозаик.  В ходе проведения экспериментов по получению датированных эмбрионов (зигот на стадии двух пронуклеусов) для индукции суперовуляции у коз применяли Folligon (Intervet International, Netherlands)  вышеописанный метод. Зиготы вымывали через 24, 36 и 48 часов после осеменения коз. В ходе эксперимента нами были получены следующие результаты: через 24 часа после осеменения было вымыто 20 зигот, что составило 16,5%, от общего количества овуляций (120 овуляция). Через 36 часов вымыли 26 эмбриона, что составило 21,6% и через 48 часов – 53 эмбрионов, что составило 44,1% от общего количества овуляций, соответственно. При этом следует отметить, что очень трудно выявить оптимальное время вымывания зигот в связи с тем, что Folligon (Intervet International, Netherlands) представляет собой гонадотропин сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК). Как известно и указано производителем ГСЖК (PMSG) содержит преимущественно фолликулостимулирующий гормон (ФСГ, FSH), а также и лютеинизирующий гормон (ЛГ, LH). Фолликулостимулирующий гормон стимулирует фоллкулогенез и до момента овуляции, а лютеинизирующий гормон стимулирует рост фолликулов на стадиях, предшествующих эструсу и овуляции и саму овуляцию. Однако это сочетание двух гормонов показало неравномерность суперовуляции, т.е. ооциты созревают не одновременно и овулируют в течение 12-16 часов, что приводит к большим трудностям по получению датированных зигот в исследованиях по получению трансгенных животных. В дальнейших исследованиях необходимо использование только фолликулостимулирующего гормона (FSH).
  Как известно визуализация пронуклеусов козьих зигот необходима для успешной микроинъекции рекомбинантной ДНК. Однако цитоплазма козьих зигот непрозрачна из-за наличия в цитоплазме различных включений, в отличие от мышиных зигот. Для улучшения визуализации пронуклеусов зигот в эксперименте  применяли центрифугирование 10000g в течение 7 мин. В эксперименте использовали 50 ооцитов и зигот, после центрифугирования для визуализации пронуклеусов их исследовали с применением контрастно-интерференционной оптики Номарского (Opton, Germany). В ходе эксперимента только у 17 зигот были визуализированы пронуклеусы, что составило 32% от общего количества исследованных ооцитов и зигот. Таким образом, центрифугирование как метод визуализации пронуклеусов козьих эмбрионов выявил 32% эффективность метода. Для получения наиболее точных и достоверных результатов необходимо проведение дальнейших исследований.  
            В ходе проведения исследований по изучению первичной  приживляемости свежеполученных эмбрионов коз в эстральный сезон были получены следующие результаты, отраженные в таблице 1.
 
Таблица 1. Первичная приживляемость свежеполученных эмбрионов коз после трансплантации
Группа
эмбрионов
Общее количество трансплан-тированных эмбрионов, n
Первичная
приживляемость, n (%)
2 - клеточные
7
4 (57,1)
4 - клеточные
10
8 (80,0)
 
Таким образом, первичная приживляемость свежеполученных 2-клеточных эмбрионов коз после трансплантации реципиентам составила 57,1% и 4-клеточных 80,0%. Первичную приживляемость определяли по отсутствию эструсов у реципиентов.
 
Түйін
Екі пронуклеус сатысындағы зиготаны алу және пронуклеусті визуализациялау әдісін қолдануды пайдаландық.
 
СПИТСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
 
1. Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S. Arylamine N-acetyltransferases: a pharmacogenomics approach to drug metabolism and endogenous function // Biochem. Soc. Trans. – 2003. – Vol. 31. – P. 615-619.
2. Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous Nacetyltransferase can be achieved in transgenic mice // Pharmacogen. J. – 2005. – Vol. 5. – C. 255-261. 8.
3. Рябых В.П., Колоскова Е.М., Езерский В.А., Трубицина Т.П., Максименко С.В. О перспективах получения трансгенных мышей–биомоделей для фармакологических и токсикологических исследований // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2015. – № 2. – С. 5-23.
4. Palmiter D.D., Brinster R.L. Transgenic mice // Cell. 1985. V.41. P.343-345
5.  Серов О.Л. Перенос генов в соматические и половые клетки. Новосибирск. Наука. 1985. С.129
6. Chan A.W. Transgenic animals: current and alternative strategies // Cloning.1999. V.1. P. 25-46
7. Brinster R.L., Chen H.Y., Trumbauer M.E.,  Yagle M.K., Palmiter R.D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 1985. V. 82. P. 4438-4442.

 

Звоните на номер:
Напишите нам
По всем вопросам, просим написать на почту! 
Мы находимся по адресу:
M02E6B9

Казахстан, г. Караганда